Este pasado año, los amantes de las nuevas tecnologías de edición genética estábamos de enhorabuena. La Academia Sueca galardonaba con el Premio Nobel de Química a las investigadoras Jennifer A. Doudna (Universidad de California, Berkeley) y Emmanuelle Charpentier (Max Planck Institute, Berlin) por ‘el desarrollo de un método de edición genómica’. Apoyándose en la ciencia básica del ‘sistema inmune’ de bacterias y arqueas (crédito, entre otros, al Dr. Francisco Mojica), los equipos de Doudna y Charpentier (y también Virginijus Siksnys) evidenciaron la aplicabilidad de CRISPR/Cas9 a la edición genómica. Y desde ese artículo en Science en 2012, desde esa primera descripción de las tijeras moleculares, muchos investigadores, grandes y pequeños, han intentado aportar su granito de arena a la mejora de la edición genética y sus aplicaciones.

Cuando acabé mi doctorado, me trasladé al laboratorio del Dr. Alberto Ciccia en la Universidad de Columbia, pensando en trabajar en la respuesta al daño en el ADN y supresión tumoral. No me imaginaba que iba a unirme al club del CRISPR y mucho menos que hoy os pudiera contar cómo mi viaje culminó con una aportación al campo de la edición genética.

Basta de preámbulos, ¿en qué se basa el estudio?

Este trabajo hace uso de una variante de la tecnología del CRISPR, los llamados editores de bases. Desarrollados en el laboratorio del Dr David Liu en el Broad Institute (Universidad de Harvard), los editores de bases consisten en una fusión de la proteína Cas9 con enzimas citidina (APOBEC1) o adenosina (tadA) desaminasas. La proteína Cas9 se ha modificado para que no realice roturas de doble cadena y sean así las enzimas quienes introduzcan mutaciones puntuales dentro de una ventana de actividad dictada por la posición del RNA guía. Basándonos en el funcionamiento del sistema CRISPR/Cas9, podemos diseñar una librería de RNA guías dirigidos a cada posición NGG para introducir las mutaciones a lo largo de toda la secuencia codificante de un gen. Así, combinando el editor de bases con la tecnología de ‘screening’ hemos conseguido generar mutaciones puntuales en 86 genes implicados en la respuesta al daño en el ADN y evaluar su efecto en respuesta a agentes genotóxicos.

¿Y cómo y para qué se puede utilizar?

Los screens con editores de bases nos permiten estudiar la función proteica con mayor resolución que los clásicos CRISPR/Cas9 screens de pérdida de función. Primero, testamos la robustez del método para análisis de mutación-fenotipo, mostrando que las mutaciones puntuales más deletéreas (codones de parada, mutaciones de splice) correspondían con fenotipos más severos mientras que mutaciones neutras (silenciosas) no diferían del fenotipo asociado a la ausencia de mutación.

Ahora sí, estábamos listos para aplicar la técnica a preguntas concretas.

Mutaciones de pérdida, ganancia y separación de función

Los genes de la respuesta al daño en el ADN suelen ser esenciales para la viabilidad celular, y codificar proteínas multidominio y multifunción. Este hecho complica su estudio por métodos tradicionales de asociación dominio-función, lo que implica que, hasta la fecha, apenas se han descrito mutaciones de ganancia o separación de función.

Por ejemplo, la proteína 53BP1 (mi proteína favorita) integra función en reparación de roturas de ADN de doble cadena y regulación del supresor de tumores p53 mediante su asociación con proteínas diferentes. Utilizando el screen con editores de bases aplicado a este gen, hemos descubierto mutaciones de pérdida y ganancia de función especificas para su regulación de p53, que no interfieren en absoluto con su función en reparación del ADN. Además, estas mutaciones nos permitieron definir una nueva superficie de interacción proteína-proteína inusual, no-canónica en 53BP1.

Interacciones mutación-respuesta a fármacos

Gracias al tratamiento con diferentes agentes genotóxicos, los screens de editores de bases nos permitieron identificar mutaciones que causaban sensibilidad o resistencia selectiva.

Muy interesante fue el caso de TRAIP, proteína pleiotrópica en la respuesta al daño en el ADN. En este caso, mutaciones en la región codificada por el exón 7 de TRAIP generaban sensibilidad a los cross-links generados por cisplatino, pero resistencia a la inhibición de topoisomerasa I por la camptotecina. Este comportamiento inusual, contrario a la letalidad general observada en mutaciones de perdida de función en TRAIP, nos permitió definir una nueva región funcional. La importancia de esta región es aún mayor si consideramos que incluye mutaciones encontradas en pacientes de microencefalia primaria.

Caracterización de mutaciones de relevancia clínica y significado desconocido.

Finalmente, me gustaría enfatizar la relevancia de esta tecnología a nivel clínico. El aumento en el uso de secuenciación masiva y paneles de genes para el diagnóstico de enfermedades hereditarias y predisposiciones genéticas ha llevado a la identificación de miles de mutaciones de ‘significado desconocido’. Los screens de editores de bases tienen potencial para caracterizar ‘in vitro’ estas mutaciones y determinar si podrían tener comportamiento patogénico. En concreto, en nuestro estudio hemos realizado análisis comparativo con mutaciones patogénicas ya descritas, y así determinado el comportamiento patogénico de mutaciones de significado desconocido en CHEK2 y genes asociados a predisposición de cáncer de mama y/o ovario.

En una frase para resumir, el uso de screens con editores de bases supone un paso adelante respecto a los screens de perdida de función actuales, ofreciendo la posibilidad de estudiar las proteínas a mayor resolución y la caracterización de mutaciones de relevancia clínica a gran escala.

El artículo original ha sido publicado en la revista Cell: Functional interrogation of DNA damage response variants with base editing screens (2021) Cuella-Martin et al., Cell 184:1081-1097. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.041

Para todas las mujeres en ciencia, por vosotras va ese graphical abstract:

El grupo dirigido por del Dr. John G. Doench ha publicado en paralelo, un artículo con análisis similares:Massively parallel assessment of human variants with base editor screens. (2021) Hanna et al., Cell 184:1064-1080. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.012

Ambos artículos han sido discutidos en un editorial en la revista Nature Review Genetics (https://www.nature.com/articles/s41576-021-00340-0) y en un spotlight en la revista Molecular Cell (https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1097276521000563?dgcid=author#)