Nuevos usos de la tecnología CRISPR: El diagnóstico

La tecnología CRISPR es, sin duda, la herramienta biotecnológica de moda en este momento. Ya hace casi tres años os contamos en qué consistía en este post. El año pasado os contamos las novedades que habían sucedido en ese período de tiempo: cómo se había ido afinando sus prestaciones, en qué campos se había probado ya y cómo estaba el tema de la batalla jurídica por sus patentes. Pues bien, tenemos que volver a hablar de CRISPR.

Recordemos, muy brevemente, que se trata de un sistema defensivo de las bacterias frente a las infecciones víricas. Este “sistema inmune” bacteriano fue descubierto por el microbiólogo español Francisco J. Martínez Mojica en el año 2005. Pero no fue hasta 2012 cuando las doctoras Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umeå y Jennifer Doudna, de la Universidad de California en Berkeley, publicaron un artículo en el que se hablaba por primera vez de la utilidad de los sistemas CRISPR/Cas como herramienta para la edición del genoma.

Desde el año 2017, los laboratorios de Doudna (Berkeley) y de Feng Zhang (Broad Institute, del MIT, otro de los pioneros de la tecnología CRISPR) han desarrollado nuevas aplicaciones en diagnóstico. En febrero de 2018 han publicado sus últimos avances en este campo en dos artículos en la revista Science. Aquí tenéis el de Douda y aquí el de Zhang.

Si recordáis, el sistema CRISPR está formado por una molécula pequeña de ARN (ARN guía)que se une específicamente a una secuencia de ADN (o ARN) y por una proteína que corta el ADN o el ARN (endonucleasa) allí donde la ha guiado el ARN guía. La proteína más conocida de este sistema es Cas9, pero no es la única. Se están investigando y hallando continuamente nuevas endonucleasas que forman parte del sistema CRISPR y que tienen distintas características, algunas de ellas muy interesantes para utilizarlas como herramientas en el laboratorio.

¿YA NO ES SÓLO UNA HERRAMIENTA PARA CORREGIR EL GENOMA?

Cuando en 2017 en el laboratorio de Zhang estaban estudiando una de estas endonucleasas, concretamente Cas13a (antes se llamaba C2c2), una endonucleasa que corta ARN, no ADN, observaron algo curioso. Después de cortar donde se le ha “indicado” mediante al ARN guía del sistema CRISPR, Cas13a “se vuelve loca” y comienza a cortar TODO el ARN que se encuentra.

¿Y esta “locura” nos vale para algo? ¿No es más bien un desastre tener algo tan inespecífico, que podría causar graves daños dentro de nuestras células? Pues como casi siempre, depende. El equipo de Zhang vio una oportunidad donde otros probablemente hubiésemos visto un desastre. Obviamente, al no cortar específicamente, no sirve para edición genética. Si queremos corregir un gen concreto, la proteína ha de cortar en ese gen, no en todas partes. Pero a cambio, sí vale como herramienta de diagnóstico. El equipo de Zang desarrolló una plataforma de diagnóstico de alta sensibilidad denominada SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)

¿Cómo funciona? Imaginemos que tenemos una muestra que queremos analizar. Queremos saber, por ejemplo, si en esa muestra está el virus del Zika. Mezclamos en el tubo de ensayo esa muestra con pequeñas moléculas de ARN a las que les hemos “pegado” a compuestos fluorescentes pero que solamente empiezan a brillar cuando se corta el ARN. Como Cas13a solo empieza a cortar “a lo loco” DESPUÉS de haber cortado la secuencia específica de ARN a la que se ha dirigido con el ARN guía, solo se detectará fluorescencia si esa secuencia está en nuestra muestra. Así, en este ejemplo, habremos diseñado una guía de ARN para el sistema CRISPR que sea específica para el virus del Zika. Si vemos fluorescencia, la muestra es positiva, existe presencia del virus. Es sumamente sencillo y brillante por eso mismo.

Esta herramienta de diagnóstico tiene muchas ventajas. Por una parte, la proteína Cas13a, es capaz de discriminar entre dos secuencias de ARN que se diferencien solamente en un nucleótido. Por lo tanto, solo cortará el ARN si se encuentra la secuencia complementaria exacta del ARN guía que le hayamos puesto (de hecho, en el artículo demuestran que es capaz de diferenciar entre la cepa americana y la africana del virus Zika). Por otra parte, para poder detectar ADN, no solo ARN y aumentar la sensibilidad de la prueba, al principio se hacen unas amplificaciones y transformaciones de ADN a ARN, con una enzima (T7 RNA polimerasa) que actúa a 37ºC. Esta temperatura permite que este paso no requiera de aparatos, sino que se haga simplemente calentando el tubo con las manos. Además, así se logra detectar una molécula de ARN entre un trillón de moléculas de ARN.

Sus utilidades van desde la detección de ADN tumoral hasta la del virus del Zika o el Dengue, pasando por la detección de bacterias patógenas y si estas son resistentes a antibióticos.

Uno de los aspectos más importantes de la plataforma SHERLOCK es que los reactivos necesarios para la detección se pueden congelar y descongelar y se pueden integrar en tiras de papel reactivo (igual que las tiras para detectar, por ejemplo, azúcar en orina). Esto es muy útil si pensamos en diagnóstico in situ en brotes epidémicos de Ébola, dengue o Zika, por ejemplo. Aunque aún no está claro, se cree que el coste de análisis de cada muestra está en torno a los 61 centavos de dólar (aunque esto no incluye el coste del detector de fluorescencia, claro).

Pero, como hemos dicho al inicio del post, el equipo de Zhang no es el único que ha utilizado el sistema CRISPR para crear una potente herramienta de diagnóstico. El laboratorio de Jennifer Doudna, ha llegado a conclusiones similares usando solamente la proteína Cas12a (antes se llamaba Cpf1). Al igual que en el caso de Zhang, ellos estaban estudiando otras proteasas. Cuando estaban probando a esta Cas12a, detectaron un comportamiento similar al que detectó el equipo de Zhang en Cas13a. Cas12a es una endonucleasa que corta ADN de doble cadena. Bien, pues cuando lo hace en la secuencia que el ARN guía le ha “indicado”, también se vuelve loca y empieza a cortar cualquier ADN de cadena sencilla que se encuentra en su camino.

La idea que se les ocurrió para aprovechar esta “locura” es la misma que al equipo de Zhang, mezcla con la muestra que queremos analizar moléculas que en este caso son de ADN de cadena sencilla, y que llevan pegados compuestos fluorescentes que solo emiten luz tras ser cortados por la proteína Cas12a. La base, la idea es exactamente igual en los dos casos. En esta ocasión, el nombre que le ha puesto el grupo de Doudna a la herramienta de detección es DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). Las características de amplificación a 37ºC son similares también a las del caso de la Cas13a. La sensibilidad es también del mismo orden de magnitud.

VERSIÓN 2.0

En febrero de 2018 el equipo de Zhang ha publicado una evolución de su plataforma SHERLOCK. Es el SHERLOCK 2. ¿Cuál es la novedad? Pues han logrado hacer una herramienta de diagnóstico múltiple. Es decir, han logrado que sea posible hacer en una misma muestra el diagnóstico a SIMULTÁNEO de varios agentes infecciosos, por ejemplo. ¿Y esto cómo lo han hecho? Pues han utilizado en vez de solo Cas13a, cuatro proteínas Cas juntas (una Cas12a, una Cas13a y dos Cas13b). Y añadieron en el mismo tubo secuencias características de corte preferente para cada proteína (en este caso también ADN, porque Cas12a corta el ADN), unidas a fluorescentes de distintos colores. Gracias a esta idea, ahora se pueden detectar, por ejemplo, cuatro agentes infecciosos a la vez.

Como vemos el sistema CRISPR/Cas aún nos guarda sorpresas y aumenta sus utilidades potenciales según pasa el tiempo y progresa la investigación.

Si os interesa seguir las investigaciones sobre CRISPR, el prestigioso investigador Lluis Montoliu, del CNB, mantiene una página web donde nos mantiene al día de todas las investigaciones relacionados con esta tecnología. Información tanto básica como avanzada al alcance de cualquiera que entienda el inglés.

By | 2018-05-28T13:39:30+00:00 febrero 21st, 2018|Artículos, Noticias|0 Comments

About the Author:

Alberto Morán
Licenciado en farmacia por la Universidad Complutense de Madrid. Realicé mi tesis doctoral en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Farmacia. Posteriormente hice un Máster en Dirección de Empresas Biotecnológicas. Trabajé casi un año en una consultoría de biotecnología. Posteriormente fui investigador y docente en la Universidad Complutense de Madrid durante siete años. Mi carrera investigadora se desarrolló en el estudio de los mecanismos moleculares del cáncer (colon y pulmón esencialmente). En noviembre de 2012 abandoné definitivamente el laboratorio. En la actualidad soy titular de una oficina de farmacia.

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