La nueva revolución en la edición génica: el Prime Editing, un paso más allá de CRISPR

En el último lustro, no hay prácticamente día que no nos levantamos sin tener una nueva noticia sobre los avances del nuevo sistema de edición genética conocido como CRISPR/Cas9. Este innovador sistema, cuyo descubrimiento ha sido merecedor del premio Príncipe de Asturias, ha permitido desarrollar la edición genética con una increíble precisión y especificad. En este post vamos a intentar explicar el último avance desarrollado por el laboratorio del Dr. Liu (1). Este laboratorio es conocido en el campo de la edición genética por el diseño de nuevas y extraordinarias herramientas. Estas nuevas herramientas se consiguen mediante la fusión de enzimas con funciones conocidas a un núcleo central de la enzima Cas9. Para entenderlo de una manera más clara, el investigador y divulgador científico Dr. Lluis Montoliu, ha utilizado un ejemplo muy ilustrativo en el que compara esta nueva Cas9 con una navaja multiusos suiza que dispone de diferentes herramientas; estas herramientas nos permiten desde cortar una tela hasta abrir una lata.

Para poder entender esta nueva “herramienta” es necesario introducir previamente un par de conceptos de biología molecular. El sistema CRISPR/Cas9, que ya se ha explicado previamente en este blog, aquí, aquí y aquí, necesita de dos componentes, además de por supuesto, el DNA que va a ser modificado:

  • La proteína Cas9: una nucleasa que corta el DNA
  • Una molécula de RNA o RNA-guía (gRNA): esta molécula de RNA se une por un extremo a Cas9 y por el otro a DNA. Esta unión al DNA es muy específica y se realiza a una determinada secuencia de DNA (la secuencia de interés) a la que Cas9 debe unirse y cortar el DNA adyacente.

La gran revolución aportada por el sistema CRISPR/Cas9 es que podemos ubicar a una nucleasa llamada Cas9 (que como ya hemos dicho, una nucleasa es una enzima capaz de cortar DNA) en la región del genoma que nosotros deseemos. Una vez allí, la nucleasa cortará la región específica del DNA y, atentos que esto es importante, la célula está obligada a repararlo. ¿Por qué digo obligada? Porque las células normales no pueden vivir si tienen cortes en el DNA. Esta “obligación” es tal, que la célula tiene incluso mecanismo que impiden que pueda sobrevivir o dividirse en caso de presentar roturas de DNA. La necesidad de reparación de la célula es tan fuerte, que la célula tenderá a corregir esa región cortada, asumiendo incluso el riesgo de introducir mutaciones (pequeñas deleciones o inserciones) en la zona. Y ese proceso de reparación tras el corte en una región especifica de DNA es lo que explota el sistema de edición genética CRISPR/Cas9. Por un lado, podemos introducir mutaciones puntuales en una región específica del DNA para eliminar la expresión de un gen, o incluso podemos suministrar a la célula con “moldes” de DNA que presenten alteraciones deseadas para corregir mutaciones puntuales. Pero fijaos, que siempre dependemos del material propio de la célula, y por qué no decirlo, un poco del azar.

El equipo de Liu ha conseguido darle una vuelta de tuerca a este sistema de edición genética combinando varias enzimas como si de una navaja multiusos se tratase. Por un lado, utilizan la enzima Cas9 junto con su gRNA; pero esta enzima tiene una particularidad, es un mutante llamado Cas9n (la letra n viene de nickase en inglés nick = mella). Esta enzima es capaz de situarse en la región del DNA indicado por el gRNA, pero no puede realizar un corte de doble cadena de DNA. Este mutante tiene, usando una analogía con unas tijeras, uno de los filos de la tijera mellado (mutaciones en su centro activo) de manera que este Cas9n se sitúa en la región del DNA deseada pero solo puede cortar una cadena. Así que Liu y su equipo decidieron acoplarle el centro activo de otra enzima para editar el genoma.

El equipo de David Liu fusiono primero a una Cas9 inactiva un fragmento de una enzima que le aportaba una actividad denominada deaminasa, capaz de transformar letras de DNA en otra, en concreto Liu y su equipo uso una enzima capaz de convertir C a T (2). Esta primera “herramienta” o variante CRISPR fue desarrollada en 2016 y se le conocio como “editores de bases”, capaces de cambiar determinadas bases del genoma de forma precisa. Sin embargo, su potencial quedó seriamente comprometido al descubrirse que producían numerosos cambios en genes no deseados. Tras este primer intento, Liu y su equipo han decidido fusionarle a la Cas9 inactiva una enzima llamada retrotranscriptasa (RT); detengámonos aquí un momento para poder entenderlo bien.

¿Qué es la enzima RT?

La RT es una enzima capaz de sintetizar DNA utilizando RNA como molde. Sí, justo al contrario de lo que indica el dogma central de la biología molecular. Este dogma indica que el DNA se transcribe en RNA y el RNA se traduce en proteínas (ver figura 1).

 

Figura 1: Dogma central de la biología molecular donde se indica claramente cómo el flujo de información genética es DNA>RNA>Proteínas. Se detalla cómo la transcriptasa reversa (RT) es capaz de revertir este flujo.

Si funciona al revés de lo habitual, ¿para qué sirve esta enzima?

Esta enzima es usada por muchos virus (incluido el del sida) pertenecientes al grupo de los retrovirus para sintetizar su material genético tras infectar células. Estos retrovirus llevan RNA como material genético, y lo primero que realizan tras infectar una célula es sintetizar DNA a partir de ese RNA. Y una vez han sintetizado el DNA viral empiezan a usarlo normalmente.

 

¿Cuál ha sido la gran o “feliz” idea?

El equipo de Liu decidió fusionar estas dos enzimas. Es una idea revolucionaria y muy acertada ya que ahora tenemos una enzima que usa el RNA para posicionarse en una región del genoma y además puede usar este RNA para sintetizar nuevo DNA. Es decir, hacemos de la necesidad virtud ya que el ARN ahora no solo servirá como guía para la Cas9, sino también como molde para producir el DNA con las ediciones genéticas que queramos introducir. La diferencia es que ahora necesitaremos un RNA un poco más largo. Simplemente indicar, que, aunque fusionar enzimas pueda sonar a ciencia ficción, es un mecanismo muy habitual en la ingeniería genética. Una enzima no es más que una cadena de aminoácidos. La información para colocar correctamente los aminoácidos se encuentra en el RNA que a su vez viene de una cadena de DNA. De manera que si nosotros empalmamos una cadena de DNA que codifica para la enzima A y lo ponemos a continuación de la cadena de DNA que codifica para la enzima B podremos producir una enzima AB que funcionará con las características de A y de B juntas.

 

Pero ¿cómo funciona?

Esta es la gran y brillante innovación. Decidieron alargar la pequeña molécula de gRNA guía (normalmente de unos 18-20 bases), que sirve para posicionar a Cas9n en una región concreta del genoma. Esta nueva molécula bastante más larga presenta ahora 2 extremos diferentes, lo que permite que se pueda usar una misma molécula de ARN para dos cosas:

 

  • Un extremo sirve como gRNA, es decir, identifica la secuencia especifica de ADN para situar la Cas9 en el lugar deseado del genoma.
  • El otro extremo sirve de molde para la RT. Esta RT, como hemos indicado, sintetiza una cadena nueva de DNA que sustituye a la que hemos cortado. Esta síntesis se realizará por la RT a partir de la secuencia que pongamos en ese nuevo extremo del ARN, de manera que podemos insertar pequeñas variaciones.

 

De esta manera, se pueden incorporar las letras correctas para corregir una mutación. O, al revés, generarla si se trata de saber qué pasa cuando ese gen está mutado.

Imagen obtenida de Addgene (https://blog.addgene.org/prime-editing-crisp-cas-reverse-transcriptase)

¿Qué aporta nuevo este sistema?

Una edición de calidad. Gracias a esta nueva herramienta modificada de CRISPR se ha conseguido una nueva forma de edición genética, basada en la generación de una proteína fusionada Cas9-RT, que no existía antes en la naturaleza. A esta desconocida capacidad la han denominado “prime editing” (PE), que en inglés juega con el doble significado de “edición de calidad” y “guiada por un molde”.

Según el equipo de Liu, en teoría, con esta nueva herramienta se podrían corregir cerca del 90 % de los más de 75000 errores genéticos que causan enfermedades en seres humanos. Y os preguntaréis ¿y por qué ese número? bueno, pues porque esta herramienta está pensada para modificar alteraciones pequeñas o puntuales que constituyen un 89% de los que se conocen. Pensad que la capacidad de edición está limitada por la propia longitud del RNA guía-molde y este no puede ser “kilométrico”.

Por ahora sabemos, gracias al trabajo de Liu, que la PE funciona en células humanas en cultivo, aunque no igual de bien con todos los tipos celulares. Es importante destacar que se 1) se logran los cambios diseñados con una buena eficiencia y, lo que es mejor, 2) se reduce muchísimo la variabilidad de los resultados y la generación de mutaciones no deseadas en otras partes del genoma.

Pero todavía no sabemos si, y cómo, funcionará en animales y en personas. Ahora nos toca esperar prudentemente a que otros laboratorios confirmen y reproduzcan los resultados para que posteriormente podamos usarlo en pacientes. A la vez que felicitar a los autores de esta fantástica idea.

Fuentes:

  1. https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
  2. https://www.nature.com/articles/nature17946

Este artículo se ha escrito con información del artículo “La CRISPR más precisa hasta la fecha convierte la tijera genética en una navaja suiza”

 

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Licenciatura Biologia (USAL), Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular con premio Abilio Paredes (UCM). Durante el doctorado realizó estancias de investigación en el hospital Mount Sinay (NY, EEUU). Durante su etapa postdoctoral ha trabajado durante 6 años en la Universidad de Pensilvania (Filadelfia, EEUU) y 2 en el Hospital Infantil de Filadelfia, CHOP (Filadelfia, EEUU) Puesto de trabajo actual. Investigador en departamento de bioquímica y biología molecular de la UCM. Faculta de Farmacia - Su investigación se ha centrado en el estudio y caracterización de nuevos genes relevantes en metastasis en los procesos tumorales con el proposito de identificar nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas. - desarrollo de modelos preclinicos para el estudio del cáncer y otras enfermedades utilizando CRISPR/Cas9

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