Identificada una proteína fundamental para la formación del virus de la peste porcina africana

¿Qué es la peste porcina africana?

Es una enfermedad vírica, frecuentemente letal, que afecta a cerdos domésticos y jabalíes. Se describió por primera vez en Kenia, en 1921, tras la importación de cerdos europeos al continente africano. Se contagia por la infección del virus de la peste porcina africana (VPPA), que se transmite generalmente mediante el contacto directo entre animales sanos e infectados o por la ingesta o el contacto con material contaminado (por ejemplo, residuos de alimentos, desechos, piensos, etc). Además, el VPPA infecta algunas especies de garrapatas que, en ciertas latitudes, actúan como reservorios y vectores biológicos (transmisores) de la enfermedad a través de la picadura.

Actualmente no hay vacunas eficaces para la prevención de esta enfermedad ni tratamientos disponibles para curarla. Por tanto, su control implica frecuentemente el sacrificio y eliminación de animales infectados o en zonas de riesgo y la prohibición del transporte de estos animales y los productos derivados, lo que causa un impacto socioeconómico muy importantes en los países afectados. En el año 2007, la enfermedad reapareció en el continente europeo (en España estuvo presente desde 1960 a 1995), tras estar más de 25 años confinada casi exclusivamente al África subsahariana, donde circula de manera continuada entre algunas especies de cerdos silvestres (que, curiosamente, se infectan sin padecer la enfermedad). Desde entonces, la enfermedad ha ido propagándose progresivamente hasta alcanzar un desarrollo explosivo en el continente asiático a partir de 2018, incluyendo de manera muy notoria a China, el mayor productor y consumidor de porcino del mundo. Esta expansión continúa en la actualidad por los cinco continentes, habiéndose notificado casos en múltiples países de la Unión Europea (14, aunque, por ahora, no en España), así como en Oceanía y, desde 2021, el continente americano (República Dominicana y Haití).

El virus de la peste porcina africana

Los virus son microorganismos infecciosos que solo pueden multiplicarse dentro de células, luego son parásitos obligatorios intracelulares. Una partícula viral infectiva, denominada virión, consiste en un ácido nucleico (ADN o ARN) rodeado por una capa de protección proteica llamada cápsida. Algunos virus están envueltos además por una membrana lipídica tomada de la célula infectada, por lo que se denominan “virus con envuelta”.  El VPPA, clasificado dentro del gran grupo de los Nucleocytoviricota (más conocidos como virus ADN gigantes), es todo eso y mucho más. Estudios previos de nuestro grupo y de otros laboratorios1,2,3 han permitido dilucidar la arquitectura del VPPA con una resolución sin precedentes mediante una técnica revolucionaria, la criomicroscopía electrónica (tres de los investigadores que la desarrollaron recibieron el premio Nobel en 2017). Así, sabemos que el virión consiste en una partícula de 250 nm de diámetro (en el límite inferior de lo detectable por un microscopio óptico), con forma icosaédrica (un icosaedro es un poliedro de 20 caras triangulares y 12 vértices) formada por 70 proteínas diferentes y cinco capas concéntricas. Desde dentro hacia fuera, el VPPA está formado por un nucleoide (1) que aloja el genoma viral (una molécula de ADN que contiene más de 150 genes), una cubierta proteica (una especie de cápsida) denominada en inglés core shell  (2), una envuelta lipídica interna (3), que el virus toma del retículo endoplásmico (una red de membranas intracelulares fundamental para la síntesis y distribución de proteínas y lípidos), una cápsida proteica externa (4), que confiere al virus su morfología icosaédrica y, por último, una envuelta lipídica externa (5), adquirida de la membrana plasmática (que separa el interior del exterior celular) durante el proceso de salida. En definitiva, el VPPA es un “virus con envuelta”, sí, pero con una arquitectura única y compleja formada por dos cápsidas y dos membranas lipídicas envolviendo el genoma viral.

El problema que queremos resolver

El ensamblaje viral dentro de la célula infectada requiere la interacción coordinada y regulada de muchos elementos diferentes, un proceso que tiene lugar en sitios específicos del citoplasma denominados factorías virales. Nuestro interés es conocer, con un nivel de detalle molecular, cómo se combinan estos elementos para producir una partícula infecciosa del VPPA.

¿Qué hemos hecho en concreto?

En este trabajo nos hemos centrado en una proteína muy pequeña (solamente 84 aminoácidos) denominada pEP84R. Sabíamos previamente que era un componente de la partícula viral (en 2018 publicamos el proteoma del virión, es decir, su composición proteica4), que probablemente estaba embebida en membranas lipídicas (según la predicción de programas bioinformáticos). Usando técnicas bioquímicas y de microscopía óptica y electrónica, demostramos que pEP84R estaba efectivamente integrada en una membrana lipídica: la envuelta interna del virión situada entre el core shell y la cápsida externa.

Después empleamos técnicas de ingeniería genética para modificar el genoma del virus, de tal manera que pudiéramos controlar específicamente la expresión del gen de pEP84R, para así estudiar su función. Básicamente, colocamos una suerte de “interruptor” delante del gen que permitiese activar su expresión mediante la adición de un compuesto químico denominado IPTG. Al infectar células con este virus modificado genéticamente (que llamaremos “virus inducible”) en presencia de IPTG, se sintetizaba pEP84R y, como resultado, el virus inducible se multiplicaba como un virus normal. En cambio, cuando omitimos el IPTG y la proteína pEP84R estaba, por tanto, ausente, descubrimos que las células no producían virus infecciosos, lo que demostraba que pEP84R era una proteína esencial para la replicación (multiplicación) del VPPA. Cuando observamos estas células con un microscopio electrónico descubrimos el por qué: se producían partículas virales “vacías” que carecían de core, tanto del nucleoide central que contiene el genoma como de la cubierta proteica (core shell) que lo rodea. Cuando analizamos la composición de las partículas vacías, confirmamos que carecían de genoma y de las proteínas que componen el core viral.

Este fenotipo – conjunto de características observables asociadas a una dotación genética concreta – mutante nos recordó inmediatamente al de otro “virus inducible” que habíamos estudiado 20 años atrás. En aquella ocasión, le habíamos colocado nuestro “interruptor” al gen de la mayor proteína del VPPA, la poliproteína pp220 (¡formada por 2475 aminoácidos!), que es el componente mayoritario del core shell. Al observar un fenotipo mutante parecido (virus vacíos), pensamos que podía haber una conexión funcional entre pEP84R y pp220 que, recordemos, se encuentran en capas adyacentes de la estructura viral (la envuelta interna rodea el core shell). Para investigar esta hipótesis, expresamos ambas proteínas en células, independientemente o en combinación, mediante un procedimiento denominado transfección (que permite la introducción de ácidos nucleicos, en nuestro caso genes virales, en una célula). En el primer caso, pEP84R se localizaba en el retículo endoplásmico (que es el orgánulo del que el VPPA obtiene su membrana interna), mientras que pp220 se encontraba en la membrana plasmática, es decir, una membrana bien diferente. Sin embargo, cuando co-expresamos ambas proteínas juntas, observamos que pp220 se redirigía al sitio donde se encontraba pEP84R, el retículo endoplásmico. Esta “colocalización” indicaba que pEP84R “guiaba” el emplazamiento correcto de pp220, lo que nos llevó, finalmente, a estudiar la posibilidad de una interacción física entre ambas proteínas. Y efectivamente, con una técnica denominada co-inmunoprecipitación, detectamos complejos macromoleculares formados por pp220 y pEP84R.

En definitiva, identificamos un mecanismo molecular, la interacción física entre pEP84R y pp220, que explica la función esencial y complementaria de ambas proteínas en la construcción del core viral.  La proteína pEP84R, embebida en la envuelta viral interna, interacciona con pp220, que a su vez interacciona con otra poliproteína del core shell, pp62 (esto ya lo sabíamos) que, a su vez, une el DNA viral del nucleoide (también lo sabíamos). Sin pEP84R, pp220 se “deslocaliza” junto con pp62 en la membrana plasmática (esto lo comprobamos en células infectadas) y se quiebra esta cadena de interacciones; como resultado, se forman virus vacíos.

 Figura: Micrografías electrónicas de partículas del virus de la peste porcina africana producidas en presencia (izquierda, panel superior) y ausencia (izquierda, panel inferior) de la proteína pEP84R y esquema de ambos tipos de partículas (derecha)/ Germán Andrés (CISA, INIA-CSIC)

¿Por qué nos parece importante?

En primer lugar, hemos descrito los elementos fundamentales de un sistema de regulación del ensamblaje de este virus desconocido previamente. Curiosamente, otros virus complejos relacionados evolutivamente con el VPPA (parientes lejanos), pero que infectan organismos muy diferentes al cerdo doméstico (por ejemplo, ¡amebas y mejillones!) poseen estructuras y componentes parecidos, que aún no se han analizado. Creemos que nuestro estudio puede proporcionar información relevante sobre el ensamblaje de virus DNA gigantes (de hecho, los más complejos de la virosfera) que proceden (probablemente) de un ancestro común.

Además, esta investigación puede tener implicaciones importantes en el desarrollo de herramientas de control de la peste porcina africana. Al descubrir una nueva proteína fundamental para la infección (y por tanto para el desarrollo de la enfermedad) y su mecanismo de acción, podemos pensar en diseñar moléculas inhibidoras que bloqueen, por ejemplo, la interacción física entre las proteínas pEP84R y pp220. Por otra parte, nuestros resultados muestran un camino para la producción de partículas virales “vacías” (en inglés, se conocen como virus-like particles) que no causan enfermedad, pero pueden inducir una respuesta inmune protectora, lo cual permitiría el desarrollo de vacunas seguras en un futuro.

¿Cómo continuar este trabajo?

Este trabajo plantea nuevas preguntas específicas directamente relacionadas con la formación de VPPA y, en concreto del core viral que contiene la información genética. Por ejemplo, nos gustaría entender mejor cómo ocurre la interacción entre las proteínas pEP84R y pp220 (es decir, qué zonas o aminoácidos concretos de ambas están implicadas) y cómo esta interacción permite o facilita la formación del core shell. Por otro lado, sabemos que pp220 y pp62, los componentes principales del core shell, son poliproteínas, es decir, polipéptidos que se cortan en proteínas más pequeñas (5 en el caso pp220, 3 en el de pp62) por la acción de una proteasa viral (unas tijeras moleculares). Este paso, denominado procesamiento proteolítico, es fundamental para que una partícula “llena”, pero no infecciosa, “madure” a una forma infecciosa (el virión). Este proceso induce una serie de transformaciones estructurales (una consecuencia es que el virus “encoje” en el proceso) que todavía no comprendemos. También nos gustaría estudiar si este mecanismo de ensamblaje es extrapolable a otros virus con estructura parecida de la misma superfamilia, en los que sabemos que existen proteínas relacionadas.

En un marco más amplio, nuestro interés principal es proseguir el estudio de los mecanismos de formación de la partícula viral infecciosa mediante el análisis de otras proteínas estructurales, cuyo papel en este proceso aún se desconoce. El VPPA se compone de unas 70 proteínas diferentes y menos de la mitad tienen una función conocida, ¡luego nos queda un largo camino!

¿Cómo hemos realizado este trabajo?

Este estudio se realizó a caballo entre el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), y el Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CBMSO), un centro mixto del CSIC y la Universidad Autónoma de Madrid. En el CISA, una instalación de alta seguridad biológica (nivel de biocontención 3+) se han realizado las manipulaciones genéticas necesarias para obtener nuestro virus inducible y otras muchas herramientas genéticas (que no explicamos aquí). Posteriormente, las muestras biológicas (una vez inactivado el virus mediante tratamientos químicos), se han analizado en su mayor parte en el CBMSO, empleando técnicas bioquímicas y de microscopía electrónica. Esta última nos ha permitido obtener las imágenes (micrografías) críticas para entender los demás resultados y establecer nuestras conclusiones. ¡Esperamos que os haya interesado!

Referencia bibliográfica

African swine fever virus transmembrane protein pEP84R guides core assembly. A Alejo, M García-Castey, M Guerra, B Hernáez, V Martín, T Matamoros, G Andrés. PLOS Pathogens; https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011136 January 30, 2023.

Otras referencias

  1. Wang N, Zhao D, Wang J, Zhang Y, Wang M, Gao Y, Li F, Wang J, Bu Z, Rao Z, Wang X. Architecture of African swine fever virus and implications for viral assembly. Science. 2019 Nov 1;366(6465):640-644.
  2. Liu S, Luo Y, Wang Y, Li S, Zhao Z, Bi Y, Sun J, Peng R, Song H, Zhu D, Sun Y, Li S, Zhang L, Wang W, Sun Y, Qi J, Yan J, Shi Y, Zhang X, Wang P, Qiu HJ, Gao GF. Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus. Cell Host Microbe. 2019 Dec 11;26(6):836-843.e3.
  3. Andrés G, Charro D, Matamoros T, Dillard RS, Abrescia NGA. The cryo-EM structure of African swine fever virus unravels a unique architecture comprising two icosahedral protein capsids and two lipoprotein membranes. J Biol Chem. 2020 Jan 3;295(1):1-12.
  4. Alejo A, Matamoros T, Guerra M, Andrés G. A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle. J Virol. 2018 Nov 12;92(23):e01293-18.
Proyecto “Tú (también) puedes hacer ciencia”
ARNs largos no codificantes (lncRNAs) como biomarcadores de cáncer

About the Author: Alí Alejo/Germán Andrés

Alí Alejo se doctoró en 1999 en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CBMSO) bajo la dirección de la Prof. Mª Luisa Salas en el grupo de investigación sobre el virus de la peste porcina africana (VPPA), dirigido por el Prof. Eladio Viñuela. Posteriormente, realizó una estancia postdoctoral en el grupo del Dr. Antonio Alcamí durante la cual estudió diversos aspectos de la evasión viral del sistema inmune utilizando poxvirus como modelo. Finalmente, desde 2009 es científico titular en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA, INIA-CSIC) donde en la actualidad desarrolla su investigación sobre aspectos fundamentales de la biología del VPPA. Germán Andrés se doctoró en 1995 en Ciencias Químicas (Universidad Autónoma de Madrid), bajo la dirección del Prof. Eladio Viñuela, en el grupo de investigación sobre el VPPA del CBMSO. Tras una etapa posdoctoral en el Laboratorio de Angiogénesis del Prof. Marco Presta (Universidad de Brescia, Italia), dirige desde 2009 una línea de investigación, primero en el CBMSO y desde 2022 en el CISA, sobre aspectos fundamentales de la biología del VPPA, como sus mecanismos de internalización y ensamblaje.

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