Por Víctor Ladero y Emilio Muñoz, de la Asociación Española para el Avance de la Ciencia.

Aislamiento, caracterización y secuencia genómica del SARS- CoV-2

En un artículo previo en DCIENCIA [1] comentamos que gracias a la rapidez con la que se obtuvo y se hizo pública la secuencia genómica del SARS-CoV-2 se ha podido avanzar a velocidades inusitadas tanto en el conocimiento de las peculiares características de este nuevo coronavirus, como en la dilucidación de la forma de entrada en nuestras células; la caracterización de la llave vírica (espícula) capaz de abrir la cerradura celular (ACE-2) para empezar el proceso de infección viral, que sin duda permitirán el desarrollo de nuevos métodos terapéuticos y preventivos. En este artículo queremos profundizar algo más en las implicaciones que ha tenido y tendrá este descubrimiento. Para ello, queremos empezar por analizar el artículo en el que se incluyó dicha secuencia genómica “A new coronavirus associated with human respiratory disease” (Un nuevo coronavirus asociado con la enfermedad respiratoria humana) depositado el 25 de Enero en BioRxiv y publicado en Nature [2] el 3 de febrero de 2020 por la fórmula de acceso abierto (Open Access).

Este artículo es un texto para la historia porque revela cambios en los patrones de ejecutar y comunicar los conocimientos científicos. El artículo describe un trabajo que responde a la categoría de big science en la que ya se lleva situando la biología genómica desde hace años con la emergencia de las técnicas ómicas, técnicas de análisis global de gran cantidad de datos, pero ahora lo hace bajo el liderazgo de científicos chinos. Firman el trabajo 19 autores de los cuales 18 son chinos y 1 australiano, que están afiliados a cuatro instituciones chinas diferentes, incluido Edward C. Holmes, un australiano de la Universidad de Sydney que también está afiliado al Centro Clínico de Salud Pública de Shangai, una de las instituciones participantes. Entre los autores destacamos a Yong-Zhen Zhang, autor para la correspondencia de este y otros artículos sobre el SARS-CoV-2. Otra de las características que dan carácter especial al trabajo es que se ha realizado con una muestra extraída del fluido del lavado broncoalveolar de un solo paciente, un enfermo de 41 años sin graves patologías anteriores, trabajador en el mercadillo de Wuhan, para la realización de un análisis metagenómico. Con ello, en esta muestra han identificado un nuevo virus de la familia Coronaviridae, virus al que se designa en el artículo de varias formas, pero una nota final de autor aclara que de acuerdo con el comité internacional pasa a denominarse SARS-CoV-2. Nos parece importante destacar el cuidadoso historial médico del enfermo y los importantes análisis filogenéticos combinando rigor médico y precisión molecular. Como comentamos, este descubrimiento ha sentado las bases para un rápido avance en el conocimiento de factores clave en la infección causada por SARS-CoV-2.

Fuente: Montaje elaborado a partir de imágenes de Wikipedia

Mecanismos de infección y estructuras implicadas

La comunidad científica ha mostrado una rapidez inaudita para dilucidar el dilema entre actuar de urgencia sobre los enfermos (medicina) y conocer las bases de la acción del virus (ciencia básica). La pregunta ¿cómo es posible que estudios estructurales que hace sesenta años requerían tiempo y desarrollos tecnológicos imaginativos y cautelosos se hayan realizado con gran rapidez en la identificación del receptor celular (cerradura) y las moléculas del virus que permiten la entrada (la llave)?

Esta rapidez ha sido utilizada como uno de los argumentos de los partidarios de las teorías de la conspiración para justificar que el virus ya era conocido, por tratarse de un virus artificial creado en un laboratorio, antes de su expansión por todo el planeta. Sin embargo, debemos pensar que los extraordinarios avances tecnológicos en estos campos, el crecimiento y abaratamiento exponencial de estas técnicas hasta hace poco novedosas se han convertido en rutina en los laboratorios de todo el mundo, incluso de los más pequeños y modestos. La publicación del genoma completo, a primeros de enero, abrió la posibilidad de generar fragmentos del mismo, mediante biología sintética, para poder expresar proteínas y cristalizarlas a velocidades increíbles. Comentamos de igual modo los artículos en los que se publican las primeras estructuras que aparecieron a mediados de febrero.

 Identificación del receptor

El receptor se identificó, aprovechando todos estos avances y los conocimientos previos de la biología del virus SARS-CoV-1, responsable del brote de SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) en el 2002, como el enzima convertidor de la angiotensina 2 (ACE-2, siglas del inglés) [3].

 Características del receptor y su implicación en la evolución de la Covid-19

El receptor ACE-2 es una exopeptidasa de membrana con distribución ubicua, aunque se encuentra principalmente en los pulmones, riñones, corazón, vasos sanguíneos, células del músculo liso, y es relativamente abundante en los testículos, debido a lo cual se ha postulado que el número de estos receptores sería mayor en hombres que en mujeres, lo que podría explicar la mayor incidencia y gravedad de la Covid-19 en los hombres. Sin embargo, aún no hay evidencias claras al respecto. También se pensaba, por el contrario, que dado que el gen que codifica para la proteína ACE-2 se localiza en el cromosoma X, las mujeres podrían tener un mayor número de proteínas ACE-2, aunque en diferentes estudios parece que el número de receptores sería similar en ambos sexos y que otros factores relacionados con una mayor actividad relacionada con diferencias en la presencia de hormonas, otros factores fisiológicos e incluso genéticos o epigenéticos explicarían una mayor actividad de este enzima en mujeres. Por otro lado, también se ha apuntado a la posibilidad de un efecto protector de la proteína ACE-2, y esto es debido a que además de participar en la regulación de la tensión arterial, tiene un efecto antiinflamatorio, por lo que una mayor actividad de este enzima en mujeres podría atenuar la tormenta de citoquinas responsable del empeoramiento en los síntomas observados en los pacientes más graves. Sin duda, un campo apasionante sobre el que será necesario seguir investigando para comprender mejor la diferente evolución de la enfermedad entre hombres y mujeres.

 Breve análisis comparado de los trabajos que identificaron ACE-2 como el receptor de SARS-CoV-2

Para entender cómo fue posible la rápida identificación de ACE-2 como la cerradura que permite abrir la entrada al virus en nuestras células, comentaremos alguna de las peculiaridades de tres trabajos científicos que participaron en esta identificación [4, 5, 6]. Los tres trabajos son ilustrativos de la intensa actividad científica focalizada sobre todas las facetas de este coronavirus y de la importancia de la comparación con el SARS CoV-1 para entender la rapidez de estos avances. Una muestra más del intenso esfuerzo investigador la encontramos en las fechas que se incorporaron al repositorio BioRxiv estos trabajos 20, 22 y 23 de enero de 2020, respectivamente; dos de los trabajos, el primero y el tercero, son de autoría china con un elevado número de autores, muchos de ellos relacionados con centros en Wuhan; el segundo trabajo ya está publicado en Nature Microbiology [6] y los dos autores pertenecen al Laboratorio de Virología de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, trabajo en el que se agradece la cooperación con los investigadores chinos de las instituciones de Wuham, un signo positivo de cooperación mientras que en el plano comercial la guerra comercial y dialéctica entre EE.UU. y China continúa abierta.

En el primer artículo, los autores postulan que ACE-2 será el receptor del virus basándose en la homología en la secuencia aminoacídica de la proteína de la espícula, y las similitudes del modelado de su estructura, con la espícula del SARS-CoV-1 y por comparación con las de otros coronavirus de murciélago que no usan la proteína ACE-2 como receptor. El 22 de enero se publica el segundo artículo en el que se demuestra que ACE-2 es realmente el receptor de SARS-CoV-2. Esta rapidez en la determinación se debe a que el grupo que lo publica estaba trabajando en la identificación de receptores para diversos coronavirus, tenía, por tanto, todo el sistema técnico y experimental a punto y tras liberarse la secuencia genómica del virus sintetizaron la región de unión de la espícula (RBD), aprovechándose de que ya se conocía que en otras espículas de coronavirus esta región se pliega de forma independiente y mantiene la misma afinidad que la espícula completa, lo que facilita trabajar con ella. Finalmente, en el tercer artículo, depositado el 23 de enero, se comprueba de forma experimental la unión del virus entero a células con ACE-2 y no a aquellas que no presentan esta proteína en su superficie.

Detalle de la unión de la región de la unión de la espícula (RBD) al receptor ACE-2 Humano. Fuente: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.22.915660v1.full.

De esta forma tenemos la confirmación de que la cerradura que abre la puerta de entrada al coronavirus a nuestras células es ACE-2, desde la predicción computacional a la demostración funcional con partículas víricas pasando por la evidencia estructural de dicha unión. Y con una diferencia de solo 3 días en su publicación, algo inaudito.

La estructura y propiedades de la espícula del virus

Es evidente que la estructura de la espícula, la llave capaz de facilitar la entrada y de ahí la infección y eventual virulencia del nuevo SARS-CoV-2 era muy importante para comprender la Covid-19 y, además, para plantearse el desarrollo de vacunas que nos protejan frente a la infección.

De igual modo, ofrecemos un breve análisis crítico en términos de como se ha producido el conocimiento y de algún resultado significativo por el orden de su inclusión en el repositorio BioRxiv o de su publicación acelerada en revistas de primera línea como Science o Nature.

El primero de ellos con el título “CryoEM structure of the 19nCoV spike in the prefusion conformation” (Estructura por microscopía crio- electrónica de la espícula del virus nCov19 en la conformación previa a la fusión) [7] fue enviado para publicación a mediados de febrero y publicado en Science el 13 de marzo de 2020. Es de origen estadounidense con 8 autores procedentes de dos instituciones: cinco de ellos del Departamento de Ciencias Moleculares de la Universidad de Texas en Austin, entre ellos el primer autor y responsable máximo de la ejecución, Daniel Wrapp, y el autor para la correspondencia, Jason McLellan, mientras que los otros tres tienen su afiliación en el Centro de Investigación sobre Vacunas de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH de sus siglas en inglés). En el trabajo se ha determinado la estructura de la espícula, una glucoproteína trimérica, por crio-microscopía electrónica a una resolución de 3,5 angstrom. Por métodos biofísicos probaron que esta proteína se fija en el receptor ACE-2 con una afinidad 10 veces superior a la del SARS-CoV-1, responsable del síndrome respiratorio agudo de 2002; por otra parte, comprobaron que los anticuerpos que tenían frente a SARS-CoV-1 no se fijan al nuevo coronavirus SARS-CoV-2.

Estructura de la espícula del virus SARS-CoV-2 obtenida mediante Cryo-EM. Fuente: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.11.944462v1.

El segundo artículo fue publicado bajo la fórmula de Articulo Previo Acelerado (Accelerated Article Preview) en Nature el 19 de marzo de 2020 con fecha de recepción del 19 de febrero, en el que se advierte que se publica sin revisión previa, y que tras la cual se pueden producir cambios o nuevas precisiones [8].

El trabajo es de origen chino con 11 autores procedentes de tres instituciones relacionadas con estudios sobre estructura de proteínas, dos de ellas en centros pertenecientes a la Universidad de Tsinghua, sita en Beijing, mientras que la tercera es una instalación o servicio (lo que en inglés se designa como facility), destinado a la Radiación Sincrotrón de la Academia China de Ciencias en Shangai.

Este articulo con el título “Structure of the SARS CoV-2 spike receptor binding domain bound to the ACE2receptor” tuvo mucha repercusión mediática por el avance que suponía para entender molecularmente la infección. Como el título anuncia, se trata de un estudio cristalográfico a una resolución de 2,5 angstrom que revela el primer paso para que se desencadene la enfermedad. Asimismo, muestran en el trabajo la convergencia existente entre los residuos que lo fijan al receptor común en los anteriores coronavirus. Sin embargo, los estudios filogenéticos respecto a la espícula desvelan que SARS-CoV-2 difiere de los previos coronavirus responsables de síndromes respiratorios agudos, SARS y MERS, por lo que se le considera un nuevo miembro de ese género que incluye los coronavirus detectados en murciélagos y en otros animales. Las homologías se mueven en el entorno del 70-80 por ciento, siendo máxima con la correspondiente del coronavirus RaTG13 que alcanza el 93,1%.

El tercer artículo es particularmente interesante y fue incluido el 20 de febrero de 2020 en el repositorio BioRxiv y posteriormente publicado en la revista Cell [9], si bien no ha tenido repercusión mediática probablemente porque se trata de una revista que no es multidisciplinar, aunque es líder mundial en el campo de la biología celular. Su título: ”Structure, function and antigenecity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein” (Estructura, función y antigenicidad de la glicoproteína de la espícula del SARS-CoV-2), anticipa la riqueza de resultados que nos vamos a encontrar. Es un artículo innovador que firman seis autores, esencialmente estadounidenses con el predominio del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Washington del estado del mismo nombre con sede en Seattle, ya que al mismo pertenecen cuatro de los autores: el autor para la correspondencia, David Wessler, y los tres primeros –los números 1 y 2 dos que comparten la responsabilidad del diseño y la parte experimental mientras que el tercero comparte su afiliación con la Unidad de Virología Estructural del Instituto Pasteur & CNR UMR3569 (un pequeño toque de cooperación internacional); finalmente los otros dos son miembros de la División de Vacunas y Enfermedades Infecciosas del Centro de Investigación Fred Hutchinson sobre el Cáncer, sito asimismo en Seattle.

Para abordar todas las facetas que el titulo indica parece obvio que tenían que apostar por un sistema más simple que un organismo entero y han usado como modelo de receptor dos tipos de células humanas, Vero E y BHK, ambas células epiteliales de riñón de mono y hámster, respectivamente y que se usan habitualmente en experimentos de infección con virus. Con esta estrategia experimental han podido mostrar cómo se produce la entrada del virus a las células y como son las espículas, el principal blanco de la inmunidad humoral. También han comparado la afinidad del enlace al receptor entre los dos coronavirus, el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV-1 que en estas condiciones experimentales dan cifras similares, al contrario que el resultado anterior [8]. También han podido identificar un sitio diana para la acción de la furina, que se localiza como una inserción entre las subunidades S1/S2 de la espícula. Es un trabajo realmente espectacular, aunque como siempre en ciencia haya que preguntarse si estas propiedades se verificarán en la complejidad del organismo humano y ante la diversidad de pacientes que, como se está viendo de la información que se destila continuamente presentan peculiaridades de respuesta que pueden derivar de deficiencias orgánicas y/o características genéticas que habrá que explorar con intensidad en el futuro próximo.

Algunos puntos para seguir con la reflexión

La rápida generación de conocimiento que nos permite el desarrollo de nuevas técnicas analíticas, especialmente las de análisis masivo de datos, que confiemos en que podrán ayudar al rápido desarrollo de una vacuna.

El destacado posicionamiento de la ciencia china, que llevaba varios años creciendo en relación a la publicación de artículos, el mantenimiento de la ciencia de EEUU y el bajo protagonismo de la ciencia europea en los primeros momentos en los que era necesaria una respuesta rápida, sin suficiente músculo es imposible lanzar un sprint.

Un aumento de la colaboración internacional, por encima de disputas políticas, en pos de avanzar en la generación de conocimiento que pueda sentar las bases del desarrollo de un tratamiento o una vacuna

Y finalmente queremos resaltar el cambio de paradigma en la publicación en abierto del conocimiento científico, los esfuerzos de los últimos años en avanzar hacia una ciencia abierta se han visto recompensados con una publicación masiva de los resultados científicos en repositorios abiertos, seguido de la publicación, también en abierto, de estos trabajos por las grandes editoriales científicas mundiales.

Referencias

[1] https://www.dciencia.es/estrategias-de-y-para-la-covid-19-cuestiones-cientificas-abiertas-a-la-reflexion/

[2] (https://www.nature.com/articles/s41586-020-2008-3)

[3] (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.20.913368v2.full)

[4] (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.22.915660v1.full)

[5] (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.22.914952v2)

[6] (https://www.nature.com/articles/s41564-020-0688-y)

[7] (https://science.sciencemag.org/content/367/6483/1260)

[8] (https://www.nature.com/articles/s41586-020-2180-5_reference.pdf)

[9] (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.19.956581v1.article-info)